近两年，PI3K/Akt/mTOR（PAM）通路的研究正在经历一轮“复兴”。

2026年发表于 Nature Reviews Drug Discovery 的一篇Perspective文章：“A renaissance in targeting the PI3K/AKT/mTOR pathway”，指出尽管该通路的药物开发曾因耐受性问题和耐药机制而受挫，但新的药理学方法和更好的生物学理解正在重新激发对这一通路进行治疗性调控的信心。

研究趋势主要体现在以下几个方向：

1.从“单靶点”走向“组合策略”： 早期的PI3K或mTOR单药抑制剂在临床上表现有限，反馈环路和其他信号通路的代偿性激活是主要障碍。当前的研究重心转向合理组合策略，包括PAM抑制剂与免疫检查点阻断剂、CDK4/6抑制剂、内分泌治疗等的联用，以及双靶点抑制剂（如同时抑制PI3K和mTOR的Gedatolisib（货号： KM2709）的开发。 

2.中药与天然产物成为重要研究源：一篇2026年的综述：“A review of PI3K/AKT/mTOR inhibitors from traditional Chinese medicine: potential and perspective for activated phosphoinositide 3-kinase δ syndrome.”

系统检索了PubMed、CNKI和万方数据库，纳入332项符合条件的研究，汇编了5种药材、99种提取物和56个复方，这些中药成分富含黄酮类、萜类、生物碱和多糖，通过靶向PAM通路发挥抗肿瘤、抗炎和免疫调节等多重药理活性。研究范式也从简单的“中药提取物→通路抑制”升级为“网络药理学预测+分子对接+实验验证”的多层次验证体系。

3.PROTAC等新模态的引入:未来的方向包括蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）、下一代PAM抑制剂以及基于生物标志物的精准患者筛选。

4.从肿瘤向非肿瘤疾病拓展:PAM通路在缺血再灌注损伤、免疫缺陷（如活化PI3Kδ综合征）、糖尿病肾病等非肿瘤疾病中的角色也受到越来越多的关注。

PI3K/Akt/mTOR（PAM）常用抑制剂激动剂：

（一）常用抑制剂

常用浓度参考：

LY294002在多数文献中使用10–20μM，部分研究用至50μM；MK-2206常用0.5–10μM；Rapamycin在Western blot验证中常用0.2μM，在细胞活性实验中常用5–20nM。

（一）常用激动剂

PAM通路的直接小分子激动剂相对匮乏，实验中常用的“激活”策略包括：

1．740Y-P（目录号：KM20188）：PI3K特异性激动剂，常用于验证化合物是否通过PAM通路发挥作用。常用浓度：文献中浓度范围较广，从1μg/mL到50μg/mL均有报道，在细胞实验中20μM是常见的工作浓度。处理时间：通常与药物共处理24-48小时，或预处理后进行后续实验。

2．YS-49（目录号：KM8636）：PI3K/Akt (RhoA 的下游靶标) 的激活剂，可减少 3-甲基胆碱处理的细胞中 RhoA/PTEN 的激活，研究表明，用YS-49处理成骨前体细胞会导致磷酸化PI3K（p-PI3K）与总PI3K的比值，以及磷酸化Akt（p-Akt）与总Akt的比值显著增加。这种激活是触发下游细胞反应的关键事件。常用剂量：10~25um。机制如下：

3．SC79（目录号：KM18640）：个特异的、能透过血脑屏障的 Akt 激动剂，可激活胞质中 Akt，并抑制 Akt 膜转位。SC79 特异性结合Akt 的PH 结构域。常用浓度：文献中常用浓度为5μM、10μg/mL、25μM等。处理时间：可预处理30-60分钟，然后与药物共处理48小时进行后续检测

4．通过上游受体激活通路的激动剂

这类激动剂通过激活受体酪氨酸激酶（RTK），间接启动PI3K/Akt信号级联。

(1) IGF-1 (胰岛素样生长因子-1)：通过与IGF-1R结合，激活PI3K/Akt通路。

常用浓度：10-100ng/mL是常见的工作浓度范围，能有效诱导Akt磷酸化。

(2) EGF (表皮生长因子)：通过与EGFR结合激活PI3K/Akt通路。

常用浓度：在MDA-MB-231细胞中，10 ng/mL可时间依赖性地激活PI3K/Akt，p-Akt水平在5分钟达到最大。

(3) PDGF (血小板衍生生长因子)：通过激活PDGFR来激活PI3K/Akt通路。常用浓度：在A549等细胞中，20ng/mL可诱导PI3K/Akt信号通路的激活。

实验设计建议

1.实验药物为抑制剂

在验证药物是否通过PI3K/Akt通路起效时，如果药物起抑制作用，建议使用740 Y-P (20μM) 或 IGF-1 (100 ng/mL) 作为挽救工具，与药物共处理24-48小时，观察激动剂能否逆转药物的效应。

一个完整的验证实验至少需要包含以下五组，以确保结果的可靠性和可解释性：

①　对照组:溶剂，用于衡量基线水平

②　药物组：你的药物（单一浓度，如IC50附近），观察药物对通路和表型的抑制效果。

③　药物 + 激动剂组（挽救组）：药物 + 激动剂（共处理），核心验证组。观察激动剂能否逆转药物的抑制效应。

④　激动剂单药组：阳性对照。如果药物效果与已知抑制剂效果一致，可增强结论的可靠性

处理时间：24-48小时。具体时间取决于你的药物产生稳定表型变化所需的时间。如果药物作用较快（如24h），可共处理24h；若需更长时间（如48h）才能观察到显著的增殖抑制或凋亡，则共处理48h。

检测指标（验证挽救是否成功）通路磷酸化水平 (Western Blot)：这是判断激动剂是否成功“激活”通路、以及药物抑制是否被“逆转”的直接证据。关键指标：p-PI3K、p-Akt (Ser473 和/或 Thr308)、p-mTOR (Ser2448) 及其对应的总蛋白。预期结果：在“药物+激动剂”组，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的水平应显著高于“药物组”，并接近或达到“对照组”或“激动剂单药组”的水平。

2.实验药物为激动剂

如果药物起激活作用，则可使用上述通路抑制剂（如LY294002或MK-2206）进行反向验证。组成性激活突变体转染：如myr-Akt1（膜靶向的组成性激活AKT），用于验证AKT下游效应。

①　对照组:溶剂，用于衡量基线水平

②　药物组：你的药物，观测p-Akt↑，表型变化（如抗凋亡/促增殖）

③　药物 + 抑制剂组（挽救组）：药物 + 通路抑制剂抑制剂逆转药物的激活效应，p-Akt回落，表型恢复

④　抑制剂单药组：仅抑制剂，用于排除抑制剂自身的基线效应

关键：如果药物 + 抑制剂组的p-Akt水平显著低于药物单药组，且药物带来的表型变化被部分或完全逆转，就证明药物是通过激活PI3K/Akt/mTOR通路发挥作用的。

处理方式：共处理 vs 预处理

推荐共处理。文献中最常见的做法是药物与抑制剂同时加入、共处理24–48 h，确保抑制剂在整个药物作用窗口内持续阻断通路。

如必须做预处理（例如验证抑制剂是否需要先阻断通路）：可将抑制剂预处理30–60 min，随后加入药物共处理至终点。

时间点设计

MK-2206在24 h内即可有效抑制p-Akt-；LY294002在48 h内可有效阻断PI3K信号。如果药物激活通路并产生表型变化需要更长时间，可延长至48 h。

核心检测指标

PAM通路的激活状态通常通过以下磷酸化位点检测：

1. p-PI3K (p85/p110) / total PI3K

2. p-AKT (Ser473 和/或 Thr308) / total AKT —— Ser473反映mTORC2活性，Thr308反映PDK1活性

3. p-mTOR (Ser2448) / total mTOR

4. p-p70S6K (Thr389) / total p70S6K —— mTORC1下游

5. p-4E-BP1 (Thr37/46) / total 4E-BP1 —— mTORC1另一下游

6. p-GSK3β (Ser9) —— AKT下游

 典型的实验设计模式

中药/化合物验证（最经典）

1. 细胞活力检测（CCK-8 / MTT）

2. Western blot检测p-PI3K、p-AKT、p-mTOR等指标

3. 加入通路激动剂（如740 Y-P） → 观察化合物能否逆转激动剂诱导的磷酸化升高

4. 加入通路抑制剂（如LY294002） → 观察化合物与抑制剂是否有协同效应

5. 下游功能验证：凋亡（Caspase-3、BAX/BCL-2）、自噬（LC3B、P62）、周期（Cyclin D1）

耐药机制研究

1. 在耐药细胞株中检测PAM通路磷酸化水平变化。

2. 使用AKT抑制剂（MK-2206）+ mTOR抑制剂（Rapamycin）联合处理，MTT检测协同效应。

3. 检测反馈激活：如MK-2206处理后p-ERK是否升高（提示MEK/ERK代偿性激活）。

网络药理学+实验验证（中药复方研究标配）

1. UPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定入血成分。

2. 网络药理学构建PPI网络，KEGG富集分析预测PAM通路。

3. 分子对接验证成分与PI3K/AKT/mTOR关键蛋白的结合。

4. Western blot和qPCR验证关键蛋白表达。

自噬调控研究

1. PAM通路是自噬的核心负调控通路（mTORC1抑制自噬）。

2. 检测LC3B-II/I比值、P62、Beclin-1。

3. 联合使用自噬抑制剂（3-MA或氯喹）验证自噬通量。

4. 注意区分“自噬性死亡”与“保护性自噬”——通常需要观察抑制自噬后细胞活力是否恢复。