嘌呤霉素（Puromycin）是一种多功能氨基核苷类抗生素，广泛应用于细胞转染筛选、蛋白质翻译研究以及动物肾病模型的构建。

核心原理：作为蛋白合成抑制剂，嘌呤霉素能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中，打乱核糖体上的肽转运导致新生肽链提前释放从而抑制蛋白合成。

筛选应用：在转染或慢病毒感实验中我们常在细胞中引入pac基因，该基因能够编码一种酶——嘌呤霉素N-乙酰转移酶 (Puromycin N-acetyltransferase, PAC)。 这种酶可以对嘌呤霉素进行乙酰化修饰，使其失活，从而保护细胞的蛋白质合成过程不受影响性选择标记。

结果：只有成功表达了pac抗性基因的细胞才能存活，其余未转染或未成功整合的基因普通细胞都会被杀死，从而实现阳性细胞的富集从而达到筛选。

嘌呤霉素作用迅速，在低浓度下即可快速导致细胞死亡。 

嘌呤霉素结构式(CAS NO. 53-79-2)

实验方法：

嘌呤霉素溶液的工作浓度需要根据细胞类型、培养基、生长条件和细胞代谢率而适当调整， 对于第一次使用的实验体系建议通过建立杀灭曲线（kill curve），来确定最佳筛选浓度。

一、杀灭曲线（kill curve）建立

1.准备24孔板，铺板目的细胞，第二天细胞汇合度应在50%～60%；

2.加入不同浓度梯度的嘌呤霉素，同时设置不加嘌呤霉素的对照组细胞，分别设置3个平行，排除其余干扰因素。具体梯度设置可以参考相关文献，或直接设置几个梯度，如：0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。

3.每隔一天更换含嘌呤霉素的培养基，嘌呤霉素的筛选至少需要48 h（一般能杀死90%以上的细胞），有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2～10天。

4.制作杀灭曲线：选取48h内可杀死90%细胞的最低浓度作为后续稳转株筛选工作浓度。

二、稳转株筛选

1.细胞转染携带抗性基因的质粒/病毒48-72h后，在细胞汇合度在60%～70%时，按照筛选出的最佳给药剂量进行给药，同时设置空白细胞对照组（未转染质粒或病毒等）。

2.当空细胞加抗生素组死亡率＞90%（常为48h），将含药筛抗生素培养基撤换为新鲜完全培养基，此时实验组剩下的基本可以认为是阳性细胞。

3.筛选的阳性细胞进行继续筛选和扩增（隔代加药维持阳性细胞率，维持浓度为工作浓度的一半，或根据空白细胞生长速度及细胞状态调整），待qPCR检测结果合格后进行冻存。

三、注意事项

1.当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显，细胞密度最好不超过25%，细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降。

2.正式实验过程中需要每日观察细胞生长状态：嘌呤霉素的筛选至少需要48 h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。

3.病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，越高MOI，含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度，调整嘌呤霉素的浓度去筛选转染细胞，但是嘌呤霉素的浓度不能低于杀死曲线的最低有效浓度。

注：感染复数（MOI,Multiplicity of Infection）:指在细胞培养实验中，平均每个细胞被分配到的病毒颗粒数量。

MOI = 加入的病毒总数量 (PFU 或 TCID50) ÷ 细胞的总数量

   ①　PFU (Plaque Forming Units)：空斑形成单位，代表有感染活性的病毒数量。     

   ②　TCID50：半数组织培养感染剂量，是另一个常用的病毒活性计量单位。

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溶解度：

DMSO : ≥ 77.5 mg/mL (142.35 mM)

H2O : 50 mg/mL (91.84 mM; Need ultrasonic and warming)

母液配置：

根据实验需求配置母液浓度：用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成母液，0.22 μm滤膜过滤除菌后分装，于-20℃分装冻存。