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AIA 关节炎模型

AA模型（Adjuvant Arthritis，佐剂性关节炎） 是一种主要在大鼠中诱导的、由T细胞介导的自身免疫性多关节炎模型，因其病理特征与人类类风湿关节炎（RA）有相似之处，被广泛用于RA的发病机制研究和抗炎药物筛选。

一、核心原理：T细胞介导的自身免疫

AA模型的本质是一种T细胞介导的自身免疫病。

其关键证据是：疾病可以通过从发病早期大鼠体内分离的淋巴样细胞（T细胞） 或致关节炎性T细胞系，过继转移给健康的同系大鼠而诱发。

关于其启动机制，一个被广泛研究的假说是分枝杆菌热休克蛋白65（Bhsp65）与关节自身抗原之间的交叉反应。疾病的发展与针对hsp65（特别是其180-186表位）的免疫反应出现相吻合，这为分子模拟机制提供了支持。

不过，该模型的一个显著特点是缺乏一个明确定义的、唯一的自身抗原，在这一点上，它反而更接近人类自发性关节炎疾病的复杂性。

二、品系：AA模型的成功高度依赖于大鼠的品系。

•  高度敏感品系：Lewis (RT.1l) 大鼠是经典的选择，发病率可达90%-100%，通常在免疫后10-12天发病，16-18天达到高峰。DA品系也常被使用。
•  相对抵抗品系：Wistar Kyoto (WKY) 和 Fisher F344 大鼠则相对抵抗。
•  小鼠通常对该模型不敏感，除非进行特殊处理（如抗IL-4抗体治疗）。

年龄与性别：6-8周龄的大鼠能获得最佳病程。性别对发病率和严重程度无显著影响。

三、诱导方案

易感大鼠单次皮下注射佐剂（足垫或尾根部），即可诱导 AIA。

关于佐剂乳化：诱导 AIA 模型，无需使用乳化后的佐剂。但是，为避免结核杆菌给药剂量不均，可将 CFA 和等体积生理盐水 / 缓冲液乳化后注射

针对低应答大鼠，佐剂必须进入淋巴系统，在引流淋巴结启动免疫应答。有文献报道：相比于简单足垫皮下注射，腹股沟淋巴结直接注射佐剂，对 F344 低应答大鼠造模效果显著更优。

1. 使用前：剧烈涡旋 / 充分颠倒摇晃试剂瓶，使沉降的结核杆菌细颗粒充分重悬。

2. 吸取混悬液装入1 mL 玻璃注射器；禁止塑料注射器（矿物油会溶胀塑料）。

3. 每一只大鼠注射之前，双手手掌来回搓滚注射器，再次重悬沉降颗粒，混匀后立刻注射，防止颗粒再次沉降。

标准的诱导方法是在第0天，将含有高浓度灭活分枝杆菌的完全弗氏佐剂（CFA） 注射到大鼠体内常见途径包括皮下（s.c.） 或皮内（i.c.） 注射，部位多选择尾根部或后足跖。

依据实验目的，选择足垫或者尾根部作为注射位点。

①足垫注射

1. 向单侧后足足垫皮下注射 0.05 mL CFA。针头刺入足垫表皮下方，针尖朝向踝关节，最大化使佐剂输送至腘引流淋巴结。

2. 注射后 30 min 即可观察严重急性局部炎症，3-4 天达炎症高峰，局部肿胀可持续 20-25 天。

3. 注射侧足爪不能纳入关节炎严重度评分，即便其余肢体没有关节炎，注射足也会持续肿胀。

4. 致敏后 12-14 天，非注射爪子出现继发性关节炎，发病后 2-3 天达到高峰；活动性关节炎症通常持续 20-25 天；部分大鼠炎症消退后，骨膜反应会造成缓慢进展的骨质肥大增生。

5. 很多机构伦理对足垫佐剂给药有限制；开展实验前需要审阅动物伦理相关规范，取得伦理委员会审批。

②尾根部注射（推荐）

1. 位点：大鼠尾根部皮下，捏起皮肤形成皮褶，针头刺入皮褶下方，回抽无回血。

2. 尾根部皮下注射 0.1 mL CFA（见图 1）。

3. 该方案优势：四只爪子均可进行关节炎评分。与足垫注射类似，注射后 12-14 天单爪或多爪出现严重关节炎，病变可持续至 20-25 天。

 图 1：尾根部皮下注射示意图

四、关节炎评价

A 评分

通过肉眼大体观察评价关节炎严重程度。造模第 10-25 天，每日大体观察记录疾病进展。

 尾根部注射：四只爪子分别评分，每爪 0-4 分；0 = 正常，1 = 最轻关节炎，4 = 最重炎症；单只大鼠最大总得分 16 分。

 足垫注射：仅对 3 只非注射爪评分，最大总分 12 分（表 2）。

除每日评分外，实验终点可以计算每只大鼠的最大关节炎指数 MAI：累加每只爪子记录到的最高得分。该指标更适合反映关节炎累积严重程度，尤其适用于前后爪发病、缓解不同步的情况 。

表 2 足爪炎症严重程度定性评分标准

CIA 关节炎模型

小鼠模型胶原诱导性关节炎（CIA）是一种被广泛研究的类风湿性关节炎自身免疫模型。在该模型中，通过免疫接种乳化在完全弗氏佐剂中的II型胶原（CII）来诱导自身免疫性关节炎。

 储存方法

1. 4 ℃避光密封玻璃容器保存，严禁冷冻，不可反复冻融；

2. 每次取用之前，剧烈涡旋振荡，使沉降的热灭活结核分枝杆菌颗粒充分分散；

3. 分装后使用，避免反复开盖污染；

4. 矿物油基质会溶胀普通塑料，储存、吸取优先使用玻璃器皿、玻璃注射器。

动物选择

CIA 的成败首先取决于小鼠品系与胶原来源的匹配。DBA/1（H-2q）和 B10.RIII（H-2r）是经典的高敏感品系，而 C57BL/6（H-2b）是低应答品系，需要完全不同的诱导策略。

前置处理

1. Ⅱ 型胶原（CⅡ）：溶解于10 mM 稀乙酸，配制成 2‑4 mg/mL；全程冰上操作；禁止接触 PBS / 高盐溶液，胶原遇盐会沉淀失活；

2. 动物品系：优先 DBA/1 小鼠（H‑2q）；B10.Q、B10.RIII 等易感品系；8‑12 周龄；避免老龄鼠；

乳剂制备（CFA + Ⅱ 型胶原，体积比 1:1，冰上全程操作）

1. 使用前 CFA 剧烈涡旋，重悬结核杆菌颗粒；

2. 按照 1:1 体积计算 CFA 和胶原溶液用量，制备时多预留 200-300 μL，弥补管壁、注射器死体积损耗；最小乳化总体积≥0.5 mL；

3. 将 CFA 加入玻璃注射器，置于冰上；

4. 匀浆器置于注射器内，中速搅拌，逐滴滴加冰上的 Ⅱ 型胶原乙酸溶液；全部加完后，调至最高转速乳化约 2 min；

5. 乳化会产生热量，注射器全程置于冰中冷却，防止胶原蛋白变性。

6. 乳化合格判定：乳剂外观类似浓稠打发奶油；取 1 滴乳剂滴入清水表面，液滴保持圆珠状、不扩散散开；如水相快速散开，乳化失败，需要重新乳化。

初次免疫（第 0 天）

1. 建议异氟烷吸入麻醉小鼠；

2. 注射位点：尾根部向远端约 1.5 cm 位置，皮下注射；单只小鼠注射体积100 μL；（不建议进行背部皮下注射或腹腔（IP）注射，因为此类乳剂可能会在腹腔和胸腔内引发严重的炎症反应。）

3. 如果计划做加强免疫，初次注射上方预留足够尾部皮肤空间。

注射操作（单侧后肢足底中部皮下）

①　麻醉与备皮:诱导麻醉后，确认踏板反射消失。对目标后肢足底剪毛，70% 乙醇消毒。

②　进针定位:从足底后半部靠近足跟处进针，针尖指向足趾方向，在足底中部皮下推进。进针不宜过深，避免伤及肌腱或骨膜；也不宜过浅，否则推注时容易漏液。

③　注射体积与速度:单次 50 μL CFA（1 mg/mL）。推注缓慢，约 5–10 s 完成。

④　拔针与确认: 缓慢旋转拔出针头，干棉球轻压针孔数秒。成功的标志是足底出现界限清楚的局部隆起（bleb），动物苏醒后出现跛行、提缩患足、舔舐注射足。

加强免疫（可选，文献不强制）

1. 初次免疫后第 14-21 d 进行加强；加强免疫必须使用 IFA（不含分枝杆菌）与胶原乳化，禁止继续使用 CFA；

2. 同样尾根部皮内注射，位点在初次注射点近端，避开之前炎症损伤部位；

3. 疾病观察与评分

病观察与评分

1. 关节炎通常在初次免疫后 28–35 天出现，Day 42–56 达到最大发生率

2. 免疫后每周观察 2-3 次；一般发病时间：免疫后 21-28 d 出现关节炎体征；

3. 单爪 0-4 分评分

每只小鼠 4 爪分别评分，单鼠最高总分 16 分；

辅助检测：卡尺测足厚度、足爪容积仪测爪体积；终点取关节组织做病理；血清检测胶原特异性抗体。

常见故障排查表